BCAS 免稀释 BCA 蛋白定量试剂盒（增强型）
规格：500T/盒
免稀释 BCA 蛋白定量试剂盒（增强型）使用说明书
预制 8 个梯度浓度标准品
562, 595 和 600 nm 波长测定
酶标仪和分光光度计通用
室温保存
试剂盒提供的试剂：
1. 试剂 A，两瓶，2 x 50 mL，室温保存；
2. 试剂 B，两管，2 x 2 mL，室温保存；
3. 蛋白标准品（预先配制的八个不同梯度浓度），固体，8 管，8 x 1 mL，室温保存。
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标准品管号
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①
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②
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③
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④
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⑤
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⑥
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⑦
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⑧
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标准品浓度
(mg/mL)
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2 | 1.5 | 1 | 0.75 | 0.5 | 0.25 | 0.125 | 0 |
检测仪器：酶标仪或分光光度计，500-600 nm，最佳波长 562 nm，可选波长 595, 600 nm。
用途：本试剂盒适用定量检测液体样本中的蛋白浓度。可以用酶标板在酶标仪上检测，和 用比色皿在分光光度计上检测。
检测范围：0.125-2 mg/mL
检测原理：蛋白质在碱性条件 下将二价铜离子还原为一价 铜离子，一价铜离子与双喹啉 甲酸（BCA）分子形成紫色络 合物，光吸收（OD）的峰值
在 562 nm 波长。光吸收值和 蛋白浓度在检测范围内具有 线性关系。
蛋白标准品溶液的配制和保存：
取 8 管蛋白标准品（BSA 干粉），每管加 1 mL 纯水，溶 解混匀即可。固体标准品可室温保存；配成液体后，短期 4°C 保存，长期可分装-20℃保 存。
工作液的配制：
1. 按 50:1 的体积比，将试剂 A 与试剂 B 混匀，现配现用。比如：2 mL 试剂 A 中，加 入 40 µL 试剂 B。工作液可以于室温保存一周，不用避光。
2. 样本液用量与工作液用量的比值是 1:10 或 1:20。用 96 孔酶标板测试时，每孔用量是 20 μL 样本液和 200 μL 工作液，比值是 1:10。用微量比色皿测试时，每个比色皿用 量是 50 μL 样本液和 1 mL 工作液，比值是 1:20。
酶标板微孔（200 μL）测试操作步骤：
1. 标准孔：取 20 μL 不同浓度的标准品， 加入到对应的标准孔中。
2. 样本孔：取 20 μL 的待测样本，加入到 对应的样本孔中。为准确定量，建议（1） 样本根据经验估计，稀释到检测范围内（0.125-2 mg/mL）的浓度检测；（2）样本也 按标准品的方法梯度稀释后，多点测试。
3. 向标准孔和样本孔加入 200 μL 的工作液，混匀。
4. 盖上酶标板盖，37℃静置孵育 30 分钟，冷却到室温。
5. 用酶标仪测定光吸收值（OD 值），最佳选用 562 nm，也可以选用 500-600 nm 范围 内的其他波长，如 595 或 600 nm。
比色皿（1 mL）测试操作步骤：
1. 标准管：取 50 μL 不同浓度的标准品， 加入到对应的标准管（可以用 1.5-mL 离 心管）中。
2. 样本管：取 50 μL 的待测样本，加入到对应的样本管（可以用 1.5-mL 离心管）中。 为准确定量，建议（1）样本根据经验估计，稀释到检测范围内（0.125-2 mg/mL） 的浓度检测；（2）样本也按标准品的方法梯度稀释后，多点测试。
3. 向标准管和样本管加入 1 mL 的工作液，混匀。
4. 37℃静置孵育 30 分钟，冷却到室温。
5. 转移液体到比色皿中，用分光光度计测定光吸收值（OD 值），最佳选用 562 nm，也 可以选用 500-600 nm 范围内的其他波长，如 595 或 600 nm。
结果计算：
1. 用标准品的检测结果作标准曲线图，拟合直线：y = ax + b （a 和 b 分别为拟合直线 的斜率和截距，y 为标准品的 OD 值，x 为标准品的浓度）。
2. 蛋白浓度计算公式为 x’ = (y’ – b)/ a（y’ 为样本的 OD 值，x’ 为样本的蛋白浓度）。 即，样本中的蛋白浓度 = (样本的 OD 值 – 截距) ÷ 斜率
3. 最后，样本中的蛋白浓度（mg/mL）要用加入检测体系之前的稀释倍数进行校正。
标准曲线示例如下：
操作注意：
1. 标准曲线。本方法为非终止反应，检测信号随检测时的条件改变而变化，因此，标准 品需要与样本同时检测，标准曲线需要每次新做。在同样的检测条件下，比较样本与 标准品，才能得出正确的结果。拟合公式（y = ax + b）中，要注意得到的系数 a 和 b 有足够的有效数字（3-4 位有效数字），来保证计算的准确性。双喹啉甲酸法（BCA）比考马斯亮蓝法（Bradford）有明显更好的线性范围，但也同样有少许弯曲。为更好
地拟合，也可以用非线性方式拟合。
2. 样本液与工作液比值。工作液中的试剂是过量的，允许根据需要对样本液与工作液比 值进行调整，用不同的比值。如：酶标板微孔采用 1:10 的比值，比色皿采用 1:20 的 比值。关键是标准品和样本在同样的条件下测试、比较，才能得出正确的结果。样本 液的体积小时，优点是可以减小样本液中其他成分的干扰，但也要注意由于体积小， 在液体转移时可能增大的误差。
3. 检测波长。反应产物的光吸收峰值在 562 nm，因而在 562 nm 处检测有最高的信号 强度，最好的检测灵敏度。然而光吸收在峰值左右逐渐衰减，在其他波长处（如：595 nm 或 600 nm）检测时，虽然偏离了最佳条件，只要标准品和样本在同样的条件下 测试、比较，也能得出正确的结果。
4. 孵育温度与时长。这里的显色反应不是终止反应，而是显色在不断增强，与温度和时
长相关。温度越高，显色越快；时间越长，显色越深。因而孵育可以是 37℃/30 分钟，
也可以是室温/两小时，或 60℃/30 分钟。要注意检测时，光吸收不要超出酶标仪或
分光光度计的线性检测范围。
5. 检测范围。检测结果要根据与标准品的比较计算，要在标准品的浓度范围内。提供的
标准品浓度在 0.125-2 mg/mL，因而，检测范围在 0.125-2 mg/mL。如有需要检测
更低的浓度，可以将提供的标准品进一步稀释作为检测对照，用最佳的检测波长（562
nm）、较长的光径（1 cm）、较高的孵育温度（60℃）、和较长的孵育时间（60 分钟）
等手段，在更低的检测范围内检测，达到更高的检测灵敏度。
注意事项:
1. 样本中避免还原性物质，如：半胱氨酸（cysteine）、二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）、 巯基乙醇（2-mercaptoethanol）、还原型谷胱甘肽（glutathione）、维生素 C（ascorbic acid）、等。
2. 样本中避免部分螯合剂，如：乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）。
3. 对检测影响不大的物质：咪唑，50 mM；Tris，25 mM；PBS，50 mM；尿素，3 M； 盐酸胍，3 M；NaCl，1 M；EDTA，10 mM；乙醇，10%；蔗糖，40%； Triton X100， 5%；Tween-20，5%。（实验显示，除 5% SDS 外，都没有明显的影响）.
